原创：陈郁芝、陈挚

前有新冠肺炎、不明肝炎，今又有猴痘，一波未平一波又起。自英国出现病例之后，短短两周内就波及了21个国家，可见传染速度之快。2023年6月6日，北京市发现两例猴痘病例后，全国各大城市开始蔓延。由于识别猴痘病毒的无症状和症状前携带者相当复杂，世界急需高敏感的快速、便携、准确的诊断工具，来对抗正在流行的猴痘疫情。传统的核酸检测、荧光分析手段尽管有效，但却受到了有限特异性、昂贵、设备庞大、操作复杂和耗时长等因素的阻碍。在前期研究中，深圳大学物理与光电工程学院研究团队已首次建立起CRISPR联合表面等离激元的生物传感方法【National Science Review, 9 (8), nwac104 (2022) ; Advanced Science, 9 (14): e2105231 (2022)】并在2022年开展了猴痘基因检测技术研究。为了快速应对国内开始的猴痘疫情，深圳大学物理与光电工程学院李学金教授团队和张晗教授团队联合开发了全球首款用于猴痘病毒的无扩增检测和基因分型的光纤生物探针检测设备，并开发猴痘检测的一次性光纤探针芯片，可实现零污染的猴痘病毒现场检测。该成果最近发表于国际顶级SCI期刊《ACS Nano》(IF: 18.027)，陈郁芝助理教授和陈挚副研究员为共同第一作者，李景枫博士、谢中建研究员、李学金教授和张晗教授为共同通讯作者。

该项研究将2020年获得诺贝尔奖的成簇的规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）生物检测技术集成于新型光纤表面等离子体共振（SPR）生物探针上。在直径仅为125 μm的微型光纤生物探针芯片上实现猴痘病毒基因的无扩增检测，在质粒中检测限低于5 aM，在假病毒的血液样本中检测限约为59.5拷贝/μL；同时具备高特异性，并能精确识别F8L基因中具有致命突变位点（L108F）的样本，可实现基因分型。

Ⅰ. CRISPR-SPR基光纤生物探针传感平台的猴痘病毒检测方案

基于SPR传感的光纤生物探针能够超灵敏度地感知其表面分子级别负载的变化。另一方面，CRISPR/Cas12a系统可以高特异性识别目标DNA，并激活设计好的报告单链DNA的反式切割机制。该团队通过在光纤生物探针上设计报告单链DNA，将光纤SPR传感和CRISPR生物检测这两种技术结合起来，提出了一种用于便携式的目标DNA检测的CRISPR-SPR基光纤生物传感平台。图1介绍了该平台检测目标猴痘病毒DNA的原理。当猴痘病毒DNA出现时，CRISPR/Cas12a系统可以反式切割报告单链DNA，释放金纳米粒子，从而导致传感器表面的负载减少，进而导致SPR信号降低。

图1. 用于猴痘病毒检测的便携式CRISPR-SPR基光纤生物探针传感平台设计示意图。所述CRISPR-SPR基光纤生物探针通过部分互补DNA修饰表面负载金纳米粒子，其中在生物传感器上设计了具有关键CRISPR反式切割位点的报告单链DNA。目标猴痘病毒DNA激活Cas12a−crRNA，导致报告单链DNA被反式切割。在CRISPR/Cas12a传感过程中，光纤生物探针将生物作用光谱信号进行实时传输和记录。传感器表面负载金纳米粒子的丢失导致SPR信号发生相应的变化。

Ⅱ. 一次性光纤生物探针

图2a展示了一次性光纤生物探针的实物照片，125 μm尺寸的微型插入式探针设计适合于各种狭小有限空间内的微量样品检测；一次性耗材设计能够有效防止生物病原体检测的交叉污染，确保病毒检测的安全性。该生物传感器采用宽带白光激发，并在传感光纤出射端面设计金反射镜，反射回收信号光，同时回程信号光在传感光纤中进行二次SPR传感，提高传感效率。图2b介绍了该生物传感器的传感原理，SPR传感是由入射光和反射光在光纤和金膜界面的总反射次数产生的倏逝场所激发。由于端面金反射镜的作用，SPR的传感效率提高了一倍，从而传感长度减半，进一步提升了该传感器的紧凑结构和实用性。图2c则展示了光纤生物探针的制备过程。

图2. 一次性使用清洁型SPR基光纤生物探针：(a) 直径125 μm的SPR基光纤生物探针的实物照片；(b) 传感器表面的光激发SPR；(c) 所述光纤生物探针的制备过程。MMF：多模光纤；CF：无芯光纤。

Ⅲ. 光纤生物探针的物理性能

光纤生物探针测试了一系列折射率升高的液体，用于模拟测量表面载荷增加。由于光纤传感区域的表面积恒定，其表面负载的变化可以通过液体密度（折射率）的变化来反映（图3a）。传感信号SPR峰的共振波长随折射率的升高而增加（图3b）。折射率梯度测量结果表明传感信号与表面载荷的变化成正比，平均灵敏度为2276.50 nm/RIU（图3c）。该团队进一步评估了光纤生物探针的温度响应（图3d）。随着温度的升高，SPR峰的共振波长向短波方向移动（图3e）。温度梯度测量结果表明，传感信号与温度变化成反比，平均灵敏度为-0.296nm/℃（图3f）。

图3. 光纤生物探针的性能：(a) 液体测量，(b) 传感信号SPR峰随液体折射率的偏移，(c)折射率灵敏度；(d) 温度测量，(e) 传感信号SPR峰随温度的偏移，(f) 温度灵敏度。

Ⅳ. 光纤生物探针的生物修饰与检测过程

图4a通过在光纤生物探针上修饰H1报告单链DNA，接着H1连接部分互补附带金纳米粒子的H3负载DNA，同时连接H2支撑DNA，再经表面封闭后，最后制成CRISPR-SPR基光纤生物探针。图4b则展示了CRISPR/Cas12a系统识别目标猴痘病毒基因后，启动反式切割机制，释放金纳米粒子，减少传感器的表面负载的检测过程图。图4c记录了光纤生物探针的CRISPR修饰与检测过程中SPR信号的变化，由图中的信号变化，该团队计算共振波长变化为[（RW1-RW2）/（RW1-RW0）]×100%，以量化目标猴痘病毒基因的浓度。

图4. 所述光纤生物探针的生物修饰与检测过程：(a) 光纤生物探针的CRISPR生物修饰过程；(b) CRISPR-SPR基光纤生物探针的猴痘病毒基因检测过程；(c) CRISPR-SPR基光纤生物探针的生物修饰与检测过程中SPR信号的时序图。

Ⅴ. CRISPR-SPR基光纤生物探针的猴痘病毒检测性能

图5a和图5b分别为CRISPR-SPR基光纤生物探针和传统荧光测定方法检测同一浓度梯度变化的猴痘病毒基因信号结果，对比可知所述光纤生物探针检测更为灵敏、具有更低的检测限，检测限达到了2.847 aM，在无需预扩增的情况下，可以检测病毒浓度低于1.8拷贝/μL的样本。图5c则为所述传感器检测猴痘与其他正痘病毒的选择性对比，结果表明本方法具备高特异性。图5d为所述传感器识别猴痘病毒F8L基因中致命突变位点（L108F）的样本，结果表明本方法对基因突变检测的选择性效果依然显著，具备病毒基因分型检测的能力。图5e在血液样本中的检测表明所述传感器在复杂样品中同样能够保持较高的灵敏度和特异性，检测限为59.5拷贝/μL，接近DNA的98.8 aM。

图5. CRISPR-SPR基光纤生物探针的猴痘病毒基因检测结果：(a) 所述光纤生物探针检测不同浓度猴痘病毒基因的信号；(b) 传统荧光测定不同浓度猴痘病毒基因的结果；(c) 所述光纤生物探针检测猴痘病毒的特异性；(d) 所述光纤生物探针识别猴痘病毒F8L基因中致命突变位点（L108F）的样本；(f) 在血液样本中，所述光纤生物探针的检测敏感性和特异性。

综上，CRISPR-SPR基光纤生物探针有效地提高了CRISPR/Cas12a系统检测猴痘病毒基因的灵敏度和特异性。在无需预扩增的情况下，该生物传感器可以检测极低浓度下的目标序列。这种便携式、超敏感和特异性的检测平台在即时检测各种病原体方面具有巨大潜力，包括新出现和发生变异的传染病病原体检测。利用CRISPR/Cas系统的集成序列识别能力和光纤SPR传感器的高灵敏度，这项工作展示了两者相结合的强大优势，如免标记、快速、便携、灵敏、特异、可编程等能力。CRISPR-SPR基光纤生物探针在面对新出现传染病的临床应用和公共卫生监测方面具有巨大的潜力。